Produkty

Na špecifickú kvantifikáciu niekoľkých metabolitov 5-fluóruracilu (5-FU) a dvoch endogénnych monofosfátových nukleotidov sme vyvinuli originálnu metódu založenú na kvapalinovej chromatografii – tandemovej hmotnostnej spektrometrii (LC-MS/MS).Tento test umožnil stanovenie: (i) intracelulárnej produkcie 5-fluór-2'-deoxyuridín-5'-monofosfátu (5-FdUMP) z 5-FU alebo 5-fluór-2'-deoxyuridínu (5-FdUrd) (ii) vplyv koncentrácie 5-FdUMP na intracelulárny pomer 2'-deoxyuridín-5'-monofosfát (dUMP)/tymidín-5'-monofosfát (TMP) a (iii) rozsah sekrécie 5-FdUMP a 5-FU z ľudských kultivovaných buniek pomocou transportérov ABC.Za našich experimentálnych podmienok boli bunky inkubované s 5-FU alebo 5-FUrd.Potom boli bunkové proteíny vyzrážané metanolom.Tento postup poskytuje vysoký výťažok extrakcie.Okrem toho sme na meranie sekrécie 5-FU a 5-FdUMP z buniek uskutočnili kvantifikáciu týchto molekúl v kultivačnom médiu.Médiá boli buď priamo injikované (5-FU), alebo prešli extrakciou tuhou fázou pomocou extrakčnej kazety Oasis Wax (5-FdUMP).Separácia analytov sa uskutočnila na kolóne dC18 Atlantis 3,5 μm, (100 mm x 2,1 mm vnútorný priemer) s izokratickým režimom s použitím pufra mravčan amónny/metanol/voda (5/5/90, obj./obj.) ako mobilnej fázy.Doba chodu nepresiahla 6,2 min.Analyty boli ionizované v elektrosprejovom rozhraní v režime negatívnych iónov.Metódu sme validovali v rozsahu 2,5–150 ng ml -1 podľa zlúčenín.Variabilita v rámci testu a medzi testami bola nižšia ako 10 % počas siedmich dní.Všetky zlúčeniny boli stabilné v bunkách alebo v kultivačnom médiu, keď boli vzorky skladované pri teplote -20 ° C počas najmenej dvoch týždňov a po troch cykloch zmrazenia a rozmrazenia.V oboch médiách nebol pozorovaný žiadny matricový efekt.