Produkty

Nový vysokovýkonný kvapalinový chromatografický test pre glykozyltransferázy založený na derivatizácii kyselinou antranilovou a fluorescenčnej detekcii.

Testy boli vyvinuté s použitím jedinečnej chémie značenia kyseliny 2-aminobenzoovej (2AA; kyselina antranilová, AA) na meranie aktivít β1-4 galaktozyltransferázy (GalT-1) a α2-6 sialyltransferázy (ST-6) pomocou vysoko výkonnej kvapaliny chromatografia (HPLC) s fluorescenčnou detekciou (Anumula KR. 2006. Pokroky v metódach fluorescenčnej derivatizácie pre vysokoúčinnú kvapalinovú chromatografickú analýzu glykoproteínových sacharidov. Anal Biochem. 350:1-23).N-acetylglukózamín (GlcNAc) a N-acetyllaktozamín sa použili ako akceptory a uridíndifosfát (UDP)-galaktóza a kyselina cytidínmonofosfát (CMP)-N-acetylneuramínová (NANA) ako donory pre GalT-1 a ST-6, v danom poradí.Enzymatické produkty sa označili in situ pomocou AA a oddelili sa od substrátov na kolóne TSKgel Amide 80 s použitím podmienok normálnej fázy.Enzýmové jednotky sa určili z plôch píkov porovnaním so súčasne derivatizovanými štandardmi Gal-pi-4GlcNAc a NANA-a2-6 Gal-pi-4GlcNAc.Stanovila sa linearita (čas a koncentrácia enzýmu), presnosť (vnútro- a intertest) a reprodukovateľnosť testov.Zistilo sa, že testy sú užitočné pri monitorovaní enzýmových aktivít počas izolácie a čistenia.Testy boli vysoko citlivé a vykonávali sa rovnako alebo lepšie ako tradičné merania na báze rádioaktívneho cukru.Formát testu sa môže použiť aj na meranie aktivity iných transferáz za predpokladu, že akceptory sacharidov obsahujú na značenie redukčný koniec.Bol vyvinutý test na glykoproteínové akceptory s použitím IgG.Na separáciu IgG glykánov (biantenárnych GO, G1, G2, mono- a disialylovaných) bola vyvinutá krátka metóda HPLC profilovania, ktorá uľahčila stanovenie aktivít GalT-1 a ST-6 rýchlym spôsobom.Okrem toho by sa táto metóda profilovania mala ukázať ako užitočná na monitorovanie zmien v IgG glykánoch v klinických podmienkach.