Produkty

Spôsob, akým sa účinky simultánnych mutácií kombinujú, aby zmenili enzymatickú aktivitu, nie je ľahko predvídateľný, pretože tieto účinky nie sú vždy lineárne aditívne.Preto charakterizácia účinkov simultánnych mutácií aminokyselinových zvyškov, ktoré viažu substrát, môže významne prispieť k pochopeniu substrátovej špecifickosti enzýmov.V beta-glykozidáze zo Spodoptera frugiperda (Sfbetagly) oba zvyšky Q39 a E451 interagujú so substrátom, čo je nevyhnutné na definovanie substrátovej špecifickosti.Dvojité mutanty Sfbetagly (A451E39, S451E39 a S451N39) boli pripravené miestne cielenou mutagenézou, exprimované v baktériách a purifikované pomocou afinitnej chromatografie.Tieto enzýmy boli charakterizované použitím p-nitrofenyl beta-galaktozidu a p-nitrofenyl beta-fukozidu ako substrátov.Pomer kcat/Km pre jednoduché a dvojité mutanty Sfbetagly obsahujúce miestne cielené mutácie v polohách Q39 a E451 sa použil na demonštráciu toho, že vplyv na voľnú energiu ESdvojitej dýky (komplex stavu enzýmu a prechodu) dvojitých mutácií (Gdouble daggerxy) nie je súčtom účinkov vyplývajúcich z jednotlivých mutácií (Gdouble daggerx a Gdouble daggery).Tento rozdiel v Gdouble dýke naznačuje, že účinky jednotlivých mutácií sa čiastočne prekrývajú.Tento spoločný efekt sa teda v Gdouble daggerxy počíta iba raz.Kryštalografické údaje o beta-glykozidázach odhaľujú prítomnosť bidentátnej vodíkovej väzby zahŕňajúcej zvyšky Q39 a E451 a rovnakú hydroxylovú skupinu substrátu.Termodynamické aj kryštalografické údaje preto naznačujú, že zvyšky Q39 a E451 majú vzájomný vplyv na ich príslušné interakcie so substrátom.